ДНХ-ийн дараалал нь гель электрофорезийг ашиглахад дасан зохицох чадвараас хамаардаг.
ДНХ-ийн дараалал
1970-аад оны сүүлээр ДНХ-ийн нуклеотидын урт хугацааны молекулын дарааллын хоёр аргыг боловсруулсан. Эдгээр нь Sanger (эсвэл dideoxy) арга болон Максам-Гилберт (химийн эвдрэл) арга байсан. Максам-Гилбертын арга нь нуклеотидын өвөрмөц хагалгаанд үндэслэсэн бөгөөд oligonucleotides (богино хугацааны нуклеотидын полимер, урт нь 50-аас бага урттай) -ийг дараалалд хэрэглэдэг. Sanger-ийн арга нь илүү өргөн хэрэглэгддэг тул техникийн хувьд илүү хялбараар нотлогдсон тул PCR болон техникийг автоматжуулснаар зарим бүх ген, түүний дотор урт хугацааны ДНХ-д хэрэглэхэд хялбар байдаг. Энэхүү арга нь ПГУ-ын суналтын урвалын үед dideoxynucleotides-ийн гинжин хэлхээний үе дээр үндэслэсэн байдаг.
Sanger арга
Sanger-ийн аргад ДНХ-ийн шинжилгээ хийхдээ ДНХ-ийн туузыг загвар болгон ашигладаг ба ДНХ полимераза нь ПГУ-ын урвалаар праймерыг ашиглан магтан үүсгэдэг.
Дөрвөн өөр төрлийн ПГУ-ын урвалын холимгийг бэлтгэсэн бөгөөд тус бүр дөрвөн нуклеотидын (ATP, CTP, GTP эсвэл TTP) -ийн нэг dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) аналогийг тодорхой хувиар бэлтгэсэн. ДНХ-ийн шинэ хэлхээний синтез нь эдгээр аналогуудын аль нэгийг үүсгэх хүртэл үргэлжилнэ.
ПГУ-ын урвал бүр ДНХ-ийн янз бүрийн урттай ДНХ-ийн холимогийг агуулна. Дараа нь гель электрофорезийг дөрвөн урвалын хэсгүүдийг салгаж, дөрвөн салангид эгнээнд байрлуулж, нуклеотидын ямар урттай төгсгөл дээр тулгуурлан анхны загварын дарааллыг тогтооно.
Автомат Sanger-ийн урвалын үед праймерыг 4 өөр өнгөтэй флюресцент шошготойгоор хэрэглэдэг. ПГУ-ын хариу урвалууд, өөр өөр dideoxy нуклеотидууд байгаа эсэхийг дээр дурдсаны дагуу гүйцэтгэнэ. Гэсэн хэдий ч, дараагийн дөрвөн урвалын холимгийг нэг гельний нэг эгнээнд нэгтгэж хэрэглэнэ. Хэсэг бүрийн өнгө нь лазерийн туяа ашиглан илэрдэг ба мэдээллийг ДНХ-ийн дарааллыг тодорхойлж болох өнгө бүрт оргил цэгүүдийг харуулсан хроматограммыг үүсгэдэг компьютер цуглуулдаг.
Ерөнхийдөө автоматжуулсан дарааллын арга нь хамгийн ихдээ 700-800 суурь хос хосолсон дэс дарааллуудын хувьд зөв юм. Гэсэн хэдий ч, томоохон генүүдийн бүтэн дараалал, үнэндээ бүх геномууд нь праймерын алхах болон цохилт дараалал зэрэг алхам аргыг ашиглах боломжтой юм.
Праймер алхахдаа томоохон генийн ажиллах хэсэг нь Sanger аргыг ашиглан дараалал үүсгэнэ. Шинэ праймеруудыг дарааллын найдвартай сегментээс гаргаж авдаг бөгөөд анхны урвалын хүрээнээс гарсан генийн хэсгийг дараалуулан үргэлжлүүлэхэд ашигладаг.
Драмын дараалал нь ДНХ-ийн сегментийг илүү зохистой (хялбаршуулсан) хэмжээтэй хэсэг болгон хувааж, хэсэг бүрийг дараалан хувааж, давхацсан дарааллууд дээр тулгуурлан хэсгүүдийг зохион байгуулдаг. Энэ аргыг компьютерийн програм хангамжийг ашиглан давхацсан хэсгүүдийг зохион байгуулахад хялбар болгосон.