ДНХ-ийн дараалал ба хувиргалтын генийн аль нь ПГУ-ыг хийх вэ?
Полимеразын гинжин урвал ( ПГУ ) нь генийн олон хуулбар хийх молекул генетик арга бөгөөд генийн дарааллын нэг хэсэг юм.
Полимераза гинжин холбоо хэрхэн ажилладаг вэ?
Генийн хуулбарыг ДНХ-ийн загвараар хийсэн бөгөөд технологи нь дээжинд олдсон генийн нэг хуулбараас олон хуулбар хийхэд хангалттай сайн байна. ДНХ-ийн хэмжээ, цэнэгийн (+ эсвэл -) хэмжигдэхүүн ба цэнэгийн дагуу харааны техникийг ашиглан генийн дарааллыг илрүүлэх, тодорхойлох генийг ПГУ-аар олшруулдаг.
Тогтмол нөхцөлд ДНХ-ийн жижиг сегментүүдийг ДНХ полимераза гэж нэрлэдэг энзимээр үүсгэгддэг бөгөөд энэ нь "загвар" гэгддэг ДНХ-ийн хэсэг болох даоксинуклеотидides (dNTPs) -ийг нэмэгдүүлдэг. ДНХ-ийн жижиг хэсгүүд нь "праймер" гэж нэрлэгддэг полимеразын эхлэлийн цэг болгон ашигладаг. Праймерууд нь ихэвчлэн 15-30 нуклеотидын урттай, хүний гараар хийсэн ДНХ (олигомер) ширхэг юм. Эдгээр нь олшруулсан генийн хамгийн төгсгөлд богино ДНХ-ийн нуклеотидын дарааллыг мэддэг буюу таах замаар хийдэг. ПГУ-ын үеэр ДНХ-ийн дараалал нь халсан бөгөөд давхар туузыг тусад нь салгана. Хөргөх үед праймер нь загварыг холбож (аннейлинг гэж нэрлэдэг) ба полимераза эхлэхэд зориулж байр бий болгоно.
ПГУ-ын техник
Полимераза гинжин урвал (ПГУ) нь thermophiles ба thermophilic полимеразын ферментийн нээлт (боломжтой бол бүтцийн нэгдмэл байдал, өндөр температурт халаахад үйл ажиллагаагаа явуулдаг ферментүүд) -аар илрүүлэх боломжтой болсон.
ПГУ-ын аргад хамрагдсан дараахь алхамууд байна:
- ДНХ-ийн загвар, полимеразын фермент, праймер, dNTP-ийн оновчтой концентрацитай холимог үүсгэнэ. Ферментийг задалгаагүйгээр хольцыг халаах чадвар нь 94 хэмийн температурт ДНХ-ийн давхаргын дээжийг ялгах боломжийг олгодог.
- Денатурацийн дараа дээжийг дунджаар 54 градусаар хөргөнө. Энэ нь праймерыг нэгтгэсэн ДНХ-ийн загварт хүргэдэг.
- Циклийн гуравдахь шатанд дээжийг Taq ДНХ полимераза-ийн хамгийн тохиромжтой температур болгон 72 градус болгож дахин халаахад зориулсан. ДНХ полимераза нь урт хугацааны туршид ДНХ-ийн анхдагч хэлхээг ашиглан нэмэлт dNTP-ыг праймерын 3-н төгсгөлд нэмж, сонирхож буй генийн бүсэд давхар тархсан ДНХ-ийн хэсгийг үүсгэнэ.
- ДНХ-ийн нуклеотидын дараалалд тохирсон праймерууд нь 72 градусын туршид хадгалагдахгүй тул ашиг сонирхлын ген рүү уртаар хязгаарладаг.
Дусалгах, анализ хийх, сунгалт хийх үйл явц нь олон дахин (30-40) удаа давтагдаж, ингэснээр холимог дахь хүссэн генийн хувилбарын тоог нэмэгдүүлнэ. Хэдийгээр гараар хийгдсэн энэ процесс нь ихээхэн төвөгтэй боловч дээжийг Термомиклер программаар бэлтгэж, ихэнх молекулын лабораторид түгээмэл байдаг бөгөөд ПГУ-ын бүрэн хариу үйлдэл 3-4 цагт хийж болно.
Дизацтай алхам бүр өмнөх өмнөх мөчлөгийн суналтын үйл явцыг зогсооно. Ингэснээр ДНХ-ийн шинэ хэлхээ багасч, хүссэн генийн хэмжээг ойролцоогоор хадгална.
Сунгах мөчлөгийн үргэлжлэх хугацааг сонирхлын генийн хэмжээнээс хамааран урт эсвэл богино хугацаагаар хийж болох боловч эцэстээ ПГУ-ын дахин давтагдах циклээр дамжуулан загваруудын олонх нь зөвхөн сонирхлын генийн хэмжээгээр хязгаарлагдана. праймерын аль алиных нь бүтээгдэхүүнээс гаргана.
Үр дүнг сайжруулахын тулд амжилттай ПГУ-ыг удирдах боломжтой хэд хэдэн хүчин зүйл байдаг . ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг турших хамгийн өргөн хэрэглэгддэг арга нь агарын гел электрофорез юм. ДНХ-ийн фрагментийг хэмжих болон цэнэглэхэд ашиглана. Дараа нь фракцийг ашиглан будагч бодис эсвэл радиоизотоп ашиглан харагдуулна.
Эволюци
ПГУ-ыг илрүүлснээс хойш анхны Taq-аас өөр ДНХ полимеразууд илрэв. Эдгээрийн зарим нь "proofreading" чадвартай эсвэл илүү өндөр температурт илүү тогтвортой байдаг тул ПГУ-ын өвөрмөц чанарыг сайжруулж, буруу dNTP-ийг оруулахаас алдааг багасгах юм.
ПГУ-ын зарим хувилбарууд нь тусгай зориулалтаар хийгдсэн бөгөөд одоо молекул генетикийн лабораторид тогтмол ашиглагддаг. Эдгээрийн зарим нь Real-Time PCR, Reverse-Transcriptase PCR юм. ПГУ-ыг илрүүлснээр ДНХ-ийн дараалал, ДНХ-ийн хурууны хээгээр болон бусад молекулын аргуудыг боловсруулахад хүргэж байна.