Полимераза гинжин хэлхээний урвалын (PCR) урвалын аль нэг бүрэлдэхүүн хэсэгт тохируулга хийх нь бүтээгдэхүүний ургац, чанарыг сайжруулж, багасгах эсвэл урвалын өвөрмөц чанар болон мэдрэмжийг сайжруулах замаар үр дүнгийн чанарыг өөрчилдөг. Эцсийн үр дүнд нөлөөлөх үзүүлэлтүүд нь физик (өөрөөр хэлбэл, температур, мөчлөгийн хугацаа) эсвэл химийн (өөрөөр хэлбэл, загвар агууламж, ашигласан ферментийн төрөл) байж болно. ПГУ-ын амжилтанд нєлєєлєх хэд хэдэн гол хїчин зїйлс нь дараахь болно.
01 Цэвэр лабораторийн нөхцөлүүд
ПГУ нь нэг л молекулын ДНХ илрүүлэх чадвартай учраас лабораторийн цэвэр нөхцлийг хадгалах нь чухал юм. Шинэ бээлий хэрэглэх, ариутгасан шилэн сав, хоолой, пипеткийн зөвлөмж, ариутгасан уусмалыг хэрэглэж, ажил эхлэхээс өмнө ажлын талбайг цэвэрлэ.
Үр дүн нь зөв дээжийг олшруулахад үр дүнтэй байхын тулд загвар ДНХ, ферментгүйгээр хяналтын урвалыг үргэлж оруулна.
Ихэнх хүмүүс өөрсдийн шийдэлд хүрч чаддаггүй шийдлүүдийг хялбархан шийдэж, зөвхөн ПГУ-д зориулж тусгайлан шийдсэн pipettes юм. DNase ба RNase -гүй ПГУ-ын хоолой, аэрозольт тэсвэртэй пипеткийн зөвлөмж, хэт ягаан туяагаар ажилладаг утаатай ажиллах нь асуудал үүсгэх арга юм.
02 Химийн бүрдэл хэсгүүд
- 18-24 давхартай
- Хоёрдогч бүтэц байхгүй (үсний хавчаар мэт гогцоо)
- G / C ба A / T хосуудын тэнцвэртэй хуваарилалт байна
- 3 футын төгсгөлд бие биенээ нөхөж чадахгүй
- Тэсрэх температур (Tm) 5-10 градусын температурт аналах температураас доогуур, ихэвчлэн 55-65 хэм хүртэл
Эхнийх нь Tm нь сайн үр дүнгийн хувьд ижил байх ёстой.
03 Reaction Mix: Загвар ба Primer
Хамгийн тохиромжтой праймер концентраци нь 0,1-6,6 микролиол / л хооронд байна. Загвар хэмжээ нь ДНХ (хүний, бактери, плазмид) төрлөөс хамаарч өөр өөр байна.
Загвар маш бага тул циклүүдийн тоог нэмэгдүүлэх, эсвэл "халуун эхлэх" гэх мэт үр дүнг сайжруулах бусад стратегиуд байдаг. Туршилтын эерэг урвал бүхий шинэ праймеруудыг туршиж үзээрэй
04 Reaction Mix: Enzyme Activity
Урвалын хольц дахь MgCl2-ийн концентраци нь ПГУ-ын үр дагаварт нөлөөлж, илүү хурдан урвалын үед чухал үүрэг гүйцэтгэж болно. Магнийн катион нь dNTP-тэй уусдаг уусдаг комплексүүд нь полимеразын ферментийг хүлээн зөвшөөрөх бодит субстратыг үүсгэдэг.
ДҮТ-ийн бүх дөрвөн тэнцүү тооны хэмжээ нь полимераза алдааны түвшинг бууруулахад тусалдаг. Бета, БАГ, угаалгын бодис, ДМСО, глицерол, пирофосфатаз зэрэг зарим нэмэлтүүд нь ферментийн өвөрмөц чанар, урвалын үр ашгийг нэмэгдүүлэхэд нөлөөлдөг.
05 Термомклерын төрөл
Лабораторийн тоног төхөөрөмж худалдан авахдаа зарим термераторыг нарийн, найдвартай температуртай байлгахын тулд бусдаас илүү нарийвчлалтай гэдгийг анхаарах хэрэгтэй.
Энэ бол удаан хугацааны туршид хямд үнээр төлөх боломжгүй газар юм. Хэрэв та хэт үр дүнтэй хариу урвалтай тулгараад байгаа эсвэл аннетийн температурын нарийн хязгаарыг шаарддаг праймеруудыг ашиглаж байгаа бол энэ талбар юм.
Таны хэрэглэж байгаа термомициллерийн нарийн брэндийн тохирох брендийн урвалын хоолойнууд нь хариу урвалын температурыг оновчтой болгоход тусалдаг.
06 Циклийн тохиргоо
Нэмэлт ургацыг 20 мөчлөг бүрт өргөтгөх хугацааг нэмэгдүүлж, илүү их загварыг олшруулах ферментийг багасгана. Ихэнхдээ 40-ээс бага мөчлөг нь 10 молекулаас бага молекулыг этидиум бромидын будагчаар агартай гель дээр харагдах хангалттай концентрацид хүрэхэд хангалттай.