Уургийн цэвэршилтийн зэрэг нь уургийн төлөвлөсөн эцсийн хэрэглээнээс хамаарна.
Зарим хэрэглээний хувьд түүхий нефть хангалттай. Гэсэн хэдий ч, хүнсний болон эм зэрэг бусад хэрэглээнд цэвэршилтийн өндөр түвшин шаардлагатай. Эдгээр хэд хэдэн уураг цэвэршүүлэх аргуудыг ашиглахын тулд ихэвчлэн хэд хэдэн цэвэршүүлэх шатанд хэрэглэдэг.
Уураг цэвэршүүлэх алхам бүр нь ихэнхдээ бүтээгдэхүүний алдагдалд хүргэдэг. Тиймээс хамгийн оновчтой уураг цэвэршүүлэх стратеги нь цөөн тооны алхмуудын хамгийн өндөр түвшинд хүрсэн байдаг. Ашиглах алхмууд нь зорилтот уургийн хэмжээ, цэнэг, уусамтгай чанар болон бусад шинж чанаруудаас хамаарна. Дараах аргууд нь нэг цитосолины уургийг цэвэршүүлэхэд хамгийн тохиромжтой байдаг. Цитосолины уургийн цогцолборыг цэвэршүүлэх нь илүү төвөгтэй бөгөөд өөр өөр арга хэрэглэхийг шаарддаг.
Уураг цэвэршүүлэх эхний алхамууд
Дотоод эс (доторх эсийн уураг) цэвэршүүлэх эхний алхам нь түүхий нефтийн бэлдмэл юм.
Энэхүү ханд нь эсийн цитоплазмын бүх уураг, холимог макромолкул, кофакт, шим тэжээл зэргийг агуулдаг. Түүхий хандыг биотехнологийн зарим хэрэглээнд ашиглаж болох боловч цэвэршилт нь асуудал бол дараагийн цэвэршүүлэх алхмуудыг дагаж мөрдөх ёстой.
Химийн бодис, фермент , sonication эсвэл French Press ашиглан эсийн задралаар үүссэн эсийн үлдэгдлийг зайлуулах замаар боловсруулагдсан уурагны хандыг бэлтгэнэ. Хагархайг центрифугт устгах ба туйлын арилгаж өгнө. Эсэргүүцэл эсийн цөмийн бэлдмэлүүдийг центрифугээр цоолж авах замаар гаргаж авч болно.
Зарим биотехнологийн хэрэглээний хувьд термостатжуулах ферментүүдийн эрэлт хэрэгцээ байдаг: өндөр температурт тэсвэрлэх чадваргүй ферментүүд, өндөр өвөрмөц үйл ажиллагааг хадгалахын зэрэгцээ. Тэдгээрийг үүсгэгч организмууд нь заримдаа extremophiles гэж нэрлэгддэг. Дулааны тэсвэртэй уургийг цэвэршүүлэх хялбар арга нь хольц дахь бусад уурагыг халааж, дараа нь уусмалыг хөргөх (шаардлагатай бол thermostable ферментийг шинэчилж эсвэл дахин дахин сольж өгөх боломжийг олгоно) Денатурацийн уургуудийг центрифугээр зайлуулж болно.
Завсрын цэвэршүүлэх алхам
Өнгөрсөн хугацаанд уургийн цэвэршилтээс хамгаалах уургийн хоёр дахь алхам бол өндөр osmotic хүч чадал (жишээ нь, давсны уусмал) уусмалаар хур тунадас оруулжээ. Түүхий ханд дахь цөмийн хүчлийг стрептомицин сульфат буюу протамины сульфатаар үүсгэсэн чулуулаг үүсгэх замаар устгаж болно.
Уураг хур тунадасыг ихэвчлэн аммонийн сульфатыг давс болгон хэрэглэдэг.
Янз бүрийн уургууд нь аммонийн сульфатын өөр өөр концентрацид тунадас болно. Ерөнхийдөө өндөр молекулын жингийн уураг нь аммонийн сульфатын доод концентрацид тунадас үүсгэдэг. Давсны тунадас нь ихэвчлэн маш өндөр цэвэршүүлсэн уураг үүсгэдэггүй боловч хольцонд зарим хүсээгүй уураг устгахад туслаж болно. Уусмал дахь давсуудыг сүвэрхэг целлюлозын хоолой, шүүх, эсвэл гельгүйжүүлсэн хроматографаар дамжуулан диализ хийнэ.
Орчин үеийн биотехнологийн протоколууд нь ихэнхдээ стандарт журмын стандартад нийцсэн бэлэн шийдлийг санал болгодог арилжааны боломжит иж бүрдэл хэрэгслүүдийг ашигладаг. Protein-ийн ариутгалыг ихэвчлэн шүүлтүүр болон гель шүүлтүүр баганаар бэлддэг. Зааврыг дагаж зөв зөв уусмалын зөв эзлэхүүнийг нэмж, шинэ сорилтын гуурс дээр ургац хураах үед (баганын нөгөө төгсгөлөөс гарч ирдэг) тодорхой хугацааны туршид хүлээнэ.
- Хроматографийн аргуудыг вандан дээд багана эсвэл автоматжуулсан HPLC тоног төхөөрөмж ашиглан хийж болно. HPLC-ийн ялгаварлалтыг урвуу фаз, ионы солилцоо буюу хэмжигдэхүүнийг хасах аргууд, диод масс эсвэл лазер технологийг илрүүлсэн дээжүүдээр хийж болно. Gg
Уурагны үзлэг ба цэвэршүүлэлтийн үнэлгээ
- Урвуу фазын хроматограф (RPC) нь тэдгээрийн харьцангуй гидрофобактив дээр үндэслэн уургийг салгана. Энэ арга нь маш сонгомол боловч органик уусгагчийг ашиглахыг шаарддаг. Зарим уургууд нь уусгагчаар бүрмөсөн гэмтэж, RPC-ийн үеэр ажиллагааны алдагдлаа алддаг. Тиймээс энэ аргыг бүх хэрэглээнд хэрэглэхийг зөвлөдөггүй. Ялангуяа зорилтот уураг нь идэвхтэй байлгах шаардлагатай байдаг.
- Ион солилцооны хроматограф нь цэнэгийг үндэслэн уургийг салгахад хамаарна. Багана нь анионы солилцоо эсвэл катион солилцоонд бэлтгэгдэж болно. Анион солилцооны багана нь эерэг цэнэгтэй хөдөлгөөнгүй фазыг агуулдаг. Катионы солилцооны багана нь эерэг цэнэгтэй уургийг татаж урвуу, сөрөг талтай судалтай байдаг. Зорилтот уургийн элемент нь уураг тус бүрт рН-ийг өөрчлөх замаар уургийн тус бүрийн уургийн функцын бүлгийн өөрчлөлт, саармагжуулалтыг бий болгодог.
- Хэмжээс гадуурх хроматограф ( гель шүүлтүүр ) нь жижиг хэсгүүдээс том уургуудаас ялгаж авдаг бөгөөд том молекулууд нь хроматографийн баганад хөндлөн холбоот полимерээр дамждаг. Том уургууд нь полимерийн нүхэнд ордоггүй бол жижиг уурагууд нь хроматографийн баганаар дамжин илүү бага шууд чиглэлтэйгээр аялдаг. Эллют нь хэмжилтийн хугацаан дахь уургуудийг салгах хэд хэдэн хоолойд цуглуулагддаг. Зориулалтын уураг нь бага хэмжээгээр шингэрүүлэх эзэлхүүнтэйгээр цуглуулсан тул багананд нэмсэнээс хойш гель шүүлтүүр нь уургийн дээжийг баяжуулах ашигтай хэрэгсэл юм. Томоохон хэмжээний уургийн үйлдвэрлэлд өртөмтгий аргыг ашиглах нь өртөг хэмнэсэн үр дүнгээс хамаардаг.
- Хроматографи нь "өнгөлөх" эсвэл уураг цэвэршүүлэх үйл явцыг дуусгах маш ашигтай арга юм. Хроматографийн баганын ирмэгүүд зорилтот уураг нь тусгайлан холбосон лигнанд дамждаг. Уг уургийг баганаас ангижруулж, чөлөөт лиг агуулсан уусмалаар зайлна. Энэ арга нь бусад аргуудтай харьцуулахад хамгийн цэвэр үр дүн, хамгийн тодорхой үйл ажиллагааг өгдөг.
- SDS-PAGE нь том цэвэр сөрөг цэнэг өгөх уураг үүсгэдэг SDS (натри додецил сульфат) -ын дэргэд хийсэн полаэкриламид гель электрофорез юм. Бүх уургийн хураамжууд хоорондоо тэнцүү учраас энэ арга нь тэдгээрийг бараг бүхэлд нь хэмжиж тус тусад нь тусгаарлана. SDS-PAGE нь цувралын дараа алхам бүрийн дараа уургийн цэвэршилтийг шалгахад ашиглагддаг. Хүсээгүй уургууд нь хольцоос аажим аажим аажмаар арилдаг тул SDS-PAGE гель дээр дүрслэгдсэн хамтлагийн тоо буурч, хүссэн уургийг төлөөлөх ганцхан хамтлаг байдаг.
- Immunoblotting нь хавсарсан хроматографтай хослуулан хэрэглэдэг уураг нүдэнд харагдахуйц арга юм. Тусгай уургийн хувьд эсрэгбиемүүдийг хавсарсан хроматографийн баганын дээр лиган болгон ашигладаг. Зорилтот уураг багана дээр үлдээж, дараа нь баганыг давстай уусмал эсвэл бусад агентуудаар зайлж зайлуулна. Цацраг идэвхт болон өнгөт шошготой холбоотой эсрэгбиемүүд нь хольцын бусад хэсгээс тусгаарлагдсан тохиолдолд зорилтот уургийг илрүүлэхэд тусалдаг.
Эх сурвалж:
Zubay G. 1988. Биохими, 2 дахь хэвлэл. Макмиллан Publishing ХХК, Нью Йорк, NY, АНУ.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Уураг цэвэршүүлэх гарын авлага, хэвлэл AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Нью Жерси, АНУ. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.